Nata a Torino nel 1909, entra alla scuola medica di Levi all'età di vent'anni dove si laurea nel 1936.
Nonostante la sua intenzione di proseguire come assistente e ricercatrice in neuribiologia e psichiatria è costretta a causa delle leggi razziali emanate dal regime fascista del 1938, è costretta, insieme con Giuseppe Levi, ad emigrare in Belgio.
Tuttavia questo non impedisce alla Montalcini di proseguire le sue ricerche, anche in un laboratorio casalingo.
Nel 1943, tornata in Italia, si trasferisce a Firenze, dove vivrà in clandestinità collaborando come medico volontario tra gli Alleati
Finita la guerra torna a Torino dove riprende le sue ricerche, sempre in un laboratorio domestico, insieme con Levi.
Poco tempo dopo il Dipartimento di Zoologia della Washington University (in Missouri) le fa un offerta difficilmente rifiutabile, Rita Levi Montalcini accetta a condizione di poter proseguire le sue ricerche iniziate a Torino.
Questo non è che l'inizio, vivrà in America per oltre trent'anni con incarichi prestigiosi, diventando professore di Neurobiologia.
I suoi primi studi negli anni 1938-1944 sono dedicati ai meccanismi di formazione del sistema nervoso dei vertebrati.
Negli anni 51-52 scopre il fattore di crescita nervoso noto come NGF, che ha un ruolo essenziale nella crescita e differenziazione delle cellule nervose sensoriali e simpatiche
Per circa trent'anni le sue ricerche proseguono su questa molecola proteica e sul suo meccanismo d'azione, dandole nel 1986 il Premio Nobel per la Medicina.
Nella motivazione si legge: "La scoperta del NGF all'inizio degli anni ‘50 è un esempio affascinante di come un osservatore acuto possa estrarre ipotesi valide da un apparente caos. In precedenza i neurobiologi non avevano idea di quali processi intervenissero nella corretta innervazione degli organi e tessuti dell'organismo".
Dal 1961 al 1969 dirige il Centro di Ricerche di Neurobiologia del Consiglio Nazionale delle Ricerche a Roma in collaborazione con l'Istituto di Biologia della Washington University, e dal 1969 al 1979 il Laboratorio di Biologia cellulare.
Si ritira da questo incarico per "raggiunti limiti d'età", tuttavia continua le sue ricerche sia come ricercatore sia guest professor dal 1979 al 1989 e fino al 1995 lavora presso l'Istituto di Neurobiologia del CNR con la qualifica di Superesperto.
Le sue ricerche si concentrano sullo spettro di azione del NGF, utilizzando tecniche sempre più sofisticate.
Dal 1993 al 1998 presiede l'Istituto dell'Enciclopedia Italiana.
Inoltre è un membro delle più prestigiose accademie scientifiche internazionali: l'Accademia Nazionale dei Lincei, l'Accademia Pontificia, l'Accademia delle Scienze detta dei XL, la National Academy of Sciences statunitense e la Royal Society.
Da sempre molto attiva in campagne di interesse sociale, nel 1992 istituisce con la sorella gemella Paola, la Fondazione Levi Montalcini in memoria del padre, rivolta alla formazione e all'educazione dei giovani, con la possibilità di borse di studio a giovani studentesse africane a livello universitario, con l'obiettivo di creare una classe di giovani donne ce svolgano un ruolo importante nella vita scientifica del loro paese.